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如何随心所欲的做好免疫组化?

生物耗材网:bioconsumable.com | 更新时间:2016-5-30

免疫组化(Immunohistochemistry) 至今也有八十余年的历史了,从 1930 年免疫组化的理论被提出讨论,一直到 1941 年以带有荧光色素的抗体,成功地观察到组织中肺炎双球菌抗原的存在,至此之后不断对于方法改良创新,也就形成了我们实验中才使用的免疫组化这门技术,先来淡谈一下免疫组化为何八十几年来还是都是实验室中的重要的实验项目之一。

人体的器官是由最小单位细胞所组成的,一般实验不论是从细胞研究蛋白或是基因,我们往往都会想知道通过最小单位的细胞放大到组织后,我们所研究的蛋白或是基因会是以何种方式的呈现在组织上呢?这时不论是研究蛋白 (免疫组化 Immunohistochemistry) 或是研究基因(原位杂交法 chromogenicin situ hybridization,CISH) 就不难理解这两门技术的重要性了。

我们首先针对实验来进行讨论,一般做组化的同仁一定会遇到的头痛问题,这个问题也就是背景 (background),背景的产生来至四面八方,从组织前处理,抗原修复,免疫阻断到最后呈色,以上这些都是有可能会造成背景的产生,所以到此撇开人为因素不谈,我们慎选一组好的免疫组化的套组对整体的实验是非常的重要。

我们一一的来讨论背景是如何产生的,从组织前处理来说,我们最开始取得组织,我们会经过一个步骤(灌流),为何要灌流呢?我们首先要知道我们免疫组化最常使用的方法就是 HRP 呈色。那我们把镜头拉回我们的组织,我们要知道组织中富含最多 HRP 的就是我们的血球,从这边大概就可以知道我们如果没有把血球处理干净的话,很容易造成在后续呈色的时候,会发现血球没有清除干净的地方就会产生我们所谓的背景了,另一个也是清除组织里面血球的方法,也就是我们免疫组化中一定会使用的过氧化酶去除剂,以上这两个方法都是有效去除我们组织上面的 HRP。

另一个步骤也是组化实验中一定会使用到但是往往会忽略的一步:抗原修复,为什么要做抗原修复呢?原因是我们取得新鲜检体时通常都会进行甲醛固定这个步骤,而甲醛固定的这个过程中会形成醛键,醛键是会封闭抗原的决定族,这种化合物封闭了抗原,一但抗原被封闭后,我们在进行抗体接合时,就会因为抗体无法辨识抗原因而造成伪阴性的情况,这也就是为什么要做抗原修复的原因,抗原修复的方法有很多种,目前最常使用的有以下三种柠檬酸缓冲液(Citrate),EDTA缓冲液,酵素(Enzyme),通常我们最常使用的是柠檬酸缓冲液,主要是它可以进行的抗原修复抗原的种类涵盖的比较广,但是还是会有一些抗原的位置是柠檬酸缓冲液无法处理的,所以进行实验时选择对的抗原修复液,也是很重要的一门功课。

再来谈到在实验中会使用的免疫阻断剂,免疫阻断剂的配方有很多种,但是其实每一种配方可能只能针对特定的背景进行去除,这时选择复合性的免疫阻断剂会对于实验更有帮助,其实我们会发现大部分进行组化实验的时候为什么都是以老鼠或是兔子的检体背景最多呢?其实这个问题不难回答,我们翻翻自己冰箱的抗体,大多数的物种就是来自于老鼠或是兔子,也因为这个缘故而造成在进行动物实验时会有背景的产生,所以免疫阻断剂的选择变成整体实验非常大的一个关键。

最后我们讨论到的呈色,不过这个跟实验法则比较相关了,我们所使用的 DAB 或是 AEC 呈色,他们的原理是以沉淀的方式进行显色,这也意味着我们呈色的实验越长颜色就会越深,所以对于呈色的时间点拿捏也是完成整个免疫组化非常重要的一个课题。

综合以上讨论的项目,做组化并不困难,其实魔鬼藏在细节里,我们只要针对每个环节每个可能产生背景的部分更细心去进行处理,免疫组化就是一项很简单的实验了。

再来我们讨论一项我们进行免疫组织染色实验设计中会遇到的问题,一般我们设计实验要研究的蛋白绝对不会有一种,我们一定会看各式各样的蛋白让我们研究主题这个故事更完整,但是一般我们进行组化只能染一种可见光的颜色,那如果我们想同时观察两种蛋白在组织上面是相互抑制或是相互增长等等的表现,我们势必会使用一种染色方法 (双染 Double stain),相信双染在座的各位一定也不陌生,但是你们熟悉的往往都是荧光的双染,这时就会有疑问了,为什么只能做荧光呢?主要是荧光双染我们是可以利用激发光的不同分开来拍摄,最后再进行图片的合成,但是这也衍生出其它的问题来,第一个 蛋白的位置,我们最开始使用免疫组化不就是为了想看我们研究的蛋白是在什么地方表现的吗?但是如果使用荧光染色就会明白只有我们蛋白表现的位置会发光,而其它的部分全都是黑的,这么一来其实就很难去讨论它表现在组织的位置是否是正确的,另一个问题 照片的合成,我们以双染来探讨,我们会先拍 DAPI 也就是核的部分,再来是我们研究的 A 蛋白 跟 B 蛋白,整个拍完之后再利用软件进行合成,第一点时间会耗费很久,第二点是合成的时候万一背景没有处理的很干净因而产生一些非专一性结合的表现,这时同时使用三张图片合成一张,这个结果图可能会变得非常不好进行数据的判断。

其实大家心里会有一个疑问,为什么不做可见光呢?其实依照以前的技术是真的比较不好进行可见光的双染,主要还是因为可见光的免疫组化同时看两种抗体如果没处理好反而会有很脏的背景,相信有想做的同仁一定都遇过上述的问题,不过近年来随着技术跟方法的提升,我们已经突破会造成背景的问题了,如此一来针对上述荧光所带来的问题,例如我们想在同一个视野下看到两种蛋白的表现还有没有背景的产生,通通会因为有这项新的技术迎刃而解了,以前进行双染有些时候是没办法做可见光才进行荧光的,不过这个问题已经解决,相信可见光的免疫组化双染,这个新技术可以为大家的研究更上一层楼。

最后要为大家介绍是最近研究非常热门的技术(原位杂交法chromogenicin situ hybridization,CISH)这个技术说新其实也不新,早在 20 世纪 80 年代末就开始发展这门技术,不过当时所研究的重点都放在 DNA 上,但是也因为技术门坎高加上成功率也不那么的稳定,造成这门技术我们在书上常看到但是实际应用其实不广,那么为什么会说是最近开始热门起来呢?其一、随着生物科技产业蓬勃发展,技术与学术不断推陈出新,早期遇到的问题都可以轻易破解,其二最近微小 RNA(Micro RNA)变成了一个主流的研究方向,早期我们不断的研究着蛋白的表现路径,随着学术知识不断的更新,我们从下游产物蛋白质不断的往上追寻,终于找到了比较前面的源头也就是微小 RNA,最早我们利用实时PCR(Realtime PCR)来进行测定,但是测定出来的结果都是一长串的数据分析,人的求知欲是无限的,随着研究时间越久人们的求知欲越高,于是回到最一开始我们提到的问题,如果有办法在组织上看到微小 RNA 的表现不知道会是什么情形呢,就是这个想法让原本沉寂已久的原位杂交法瞬间变成了学术及研究界中的新星,这个方法满足了我们所有的求知欲,随着技术改进,原位杂交法实验步骤变得容易,研究的方向从最早的 DNA,RNA 到最近的微小 RNA 都可以进行研究,而另一个更好的优点则是她并不受蛋白质裂解的影响,综合以上优点不难理解为什么大家争先恐后的要使用这门技术了。

组织研究是在学术研究上不可抹灭及取代的一块研究领域,我们将病理组织相关研究技术不断的研究及推陈出新,一直秉持着走在研究技术的最前端,在将来我们要把目前最火红的两门技术原位杂交法及免疫组化双染同时进行在同一个组织上,也就是意味着我们一个组织可以同时看到基因的表现也可以同时观察到蛋白质的表现,相信这门新兴的技术会再一次把病理组织这门技术推上更高的巅峰。

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